Padronização e aplicação de qPCR duplex para análise de variações no número de cópias do gene CYP2C19

Introdução

Pacientes submetidos à angioplastia frequentemente recebem prescrição de clopidogrel, cuja bioativação ocorre por meio da enzima CYP2C19. Aproximadamente 30% dos pacientes não respondem ao tratamento e podem apresentar risco aumentado de eventos cardiovasculares adversos. Além de variantes de nucleotídeo único, variações no número de cópias (CNV) do gene CYP2C19 (deleções e duplicações) também podem influenciar essa resposta, mas não são detectadas pela genotipagem convencional. A PCR digital (ddPCR) é o método mais utilizado para detectar CNVs, porém sua disponibilidade ainda é limitada no Brasil; a qPCR com sondas Taqman representa uma alternativa acessível. Contudo, protocolos padronizados com essa finalidade ainda são escassos.

Objetivo

Padronizar um ensaio de qPCR duplex para estimar CNVs no gene CYP2C19 para futuras aplicações em farmacogenética.

Método

O estudo foi conduzido em duas etapas. Primeiro, padronizou-se o protocolo de qPCR com sete amostras de DNA genômico, avaliando-se o efeito da concentração do DNA sobre a qualidade da amplificação em duas corridas independentes (sem diluição e após diluição para a faixa de 20 a 30 ng/µL). Utilizaram-se o ensaio TaqMan Hs05164104_cn da ThermoFisher para CYP2C19 (canal FAM) e o ensaio de referência RNase P (canal VIC), em triplicata, no equipamento QuantStudio 3. Os CNVs foram estimados pelo software CopyCaller v2.1, com base em critérios de qualidade definidos pelos parâmetros σ(ΔCt), flags de amplificação, Z-score e confidence. Depois, o protocolo foi aplicado a 110 amostras de uma coorte de pacientes com doenças cardiovasculares do HC-UFTM.

Resultados e discussão

A padronização mostrou que o melhor desempenho foi observado na faixa de 20 a 30 ng/µL de DNA; concentrações fora dessa faixa interferiram nas estimativas de CNV. A reação final teve um volume de 10 µL, contendo 5 µL de Master Mix, 0,5 µL da sonda para CYP2C19, 0,5 µL de RNase P, 2 µL de DNA e 2 µL de água livre de nucleases. A análise em triplicata foi adotada para avaliar a concordância entre as replicatas e aumentar a confiabilidade da chamada de CNV. Na aplicação em 110 pacientes, 107 (97,3%) apresentaram número de cópias predito = 2, equivalente ao padrão diploide, enquanto 3 pacientes (2,7%) apresentaram CNV = 1, indicando uma possível deleção parcial do gene CYP2C19. Essa frequência é consistente com dados da literatura: alelos como o *36 e *37, respectivamente deleções total e parcial, não são detectados por genotipagem convencional. A diretriz CPIC de 2022 para CYP2C19 e clopidogrel orienta a genotipagem para condução da terapia antiagregante, porém não contempla a análise de CNVs, o que reforça a importância de protocolos baseados em qPCR, que podem ser aplicados em laboratórios que disponham desse equipamento, ampliando as possibilidades de investigação de CNVs do CYP2C19.

Conclusão

O protocolo padronizado permitiu a análise de CNVs no gene CYP2C19 em pacientes pós-angioplastia do HC. A identificação de amostras com CN = 1 sugere a presença de uma deleção parcial, que pode não ser detectada pela genotipagem convencional, reforçando a importância de investigar CNVs na farmacogenética de pacientes em uso do clopidogrel.

Palavras-chave

• CYP2C19
• CNV
• qPCR
• TaqMan
• clopidogrel